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利用氨基酰化酶的专一性, 只水解Ac-L-phe的酰氨键, 生成L-phe, 而不能水解Ac-D-phe的酰胺。 然后根据L-phe和Ac-D-phe在水中的溶解度不同进行分离。而分离出的Ac-D-phe又可经消旋化生成Ac-DL-phe。 再一次重复水解、分离。 依次类推, 可将Ac-DL-phe全部转化为L-phe。
固定化氨基酰化酶的制备 将DEAE-sephadexa-50放入去离子水中充分浸泡后, 再依次用10倍量的0.5mol/L HCl和0.5mol/L NaOH溶液充分搅拌处理30min。 然后用去离子水洗至中性, 后分别用0.1mol/L及0.01mol/L的pH=7.0的磷酸缓冲液处理1-2h, 滤干, 备用。 取经培养40-50h 的米曲扩大曲, 用其6倍量的支离子水分2次提取, 提取液用2mol/L的NaOH溶液调pH至6.7-
然后按100L酶液和1kg湿DEAE-sephadex A-50的比例混合, 于0-4℃搅拌吸附4-5h后, 过滤取DEAE-sephadexA-50, 并分别用去离子水0.1mol/L NaAc溶液、0.01mol/L 的pH=7.0的磷酸缓冲液洗涤3-4次。 过滤得固定化氨基酰化酶, 加1%甲苯放入冷库中贮存备用。
酶水解 在1000L水解罐中, 加入700L 0.1mol/L Ac-DL-phe钠盐溶液, 再逐步加入6mol/L的HCl调溶液pH至6.7-7.0, 再加入15-20kg固定化氨基酰化酶, 维持50℃约4h进行酶选择性水解反应后, 过滤取滤液, 得酶水解液(含L-phe和Ac-D-phe混合液)。
分离 将酶水解液用6mol/L的HCl调pH至4.8-5.1, 减压浓缩至35L左右, 并将其放置于0℃结晶过夜, 过滤取结晶, 用10L冷乙醇洗涤, 于80℃烘干3-4h, 得L-phe粗品, 滤液和洗涤液合并, 减压浓缩至20L左右, 得Ac-D-phe溶液, 待外消旋化后再重复进行酶水解、分离。
精制 在100L反应罐中, 加入5kg L-phe粗品, 加50L去离子水, 加热至100℃, 搅拌使其全溶, 再加入药用活性炭0.25kg, 搅拌脱色半小时后,趁热过滤, 滤液移入200L结晶罐中, 冷却至40℃, 加入50L, 40℃的95%乙醇,用6mol/L的HCl调pH至5.48, 于0℃结晶过夜, 过滤取结晶,用95%乙醇洗涤, 抽干, 80℃干燥3-4h, 得L-phe成品。母液再回收。
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