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在柠檬酸的工业生产中都采用微生物发酵法，而有价值的只有几种曲霉菌和酵母菌，其中黑曲霉菌是工业中具有竞争力的菌种，酵母中竞争力强的有解脂假丝酵母和季也蒙赤酵母等。
黑曲霉是在琼脂上培养的，在琼脂上成局限菌落，在室温下培养10~14天，成为丰富密集的孢子梗，菌落为黑色，有时也为深褐黑色。考虑到柠檬酸生产菌应具有产酸能力强和耐柠檬酸浓度高的特点，可采用酸性滤纸法、变色圈法和单孢子移植法将黑曲霉分离出来，以避免其他杂菌干扰，使其成为生产柠檬酸用黑曲霉。酵母的培养可用于柠檬酸生产的酵母有解脂假丝酵母和季也蒙假丝酵母2种。前者有很强的分解脂肪的能力，较好的炭源是正烷烃。后者可由烷烃发酵生成柠檬酸，也可由糖类发酵生成柠檬酸，酵母发酵pH值为3.5~4.0。 [20]
发酵

1940年，H.A.克雷伯斯提出三羧循环学说以来，柠檬酸的发酵机理逐渐被人们所认识。已经证明，糖质原料生成柠檬酸的生化过程中，由糖变成丙酮酸的过程与酒精发酵相同，亦即通过E-M途径（二磷酸己糖途径）进行酵解。然后丙酮酸进一步氧化脱羧生成乙酰辅酶A，乙酰辅酶A和丙酮酸羧化所生成的草酰乙酸缩合成为柠檬酸并进入三羧循环途径。
柠檬酸是代谢过程中的中间产物。在发酵过程中，当微生物体内的乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶活性很低、而柠檬酸合成酶活性很高时，才有利于柠檬酸的大量积累。 [21]
发酵工艺分表面发酵和固体发酵，按不同工艺制备不同原料的培养基，然后进行蒸料。蒸料的目的是将淀粉糊化，并进行灭菌。蒸料时要使物料受热均匀，蒸汽通畅，边蒸边加料，把料加在冒汽的地方，逐层加入。蒸好的物料要扬散摊凉，当温度降至37 ℃以下，即可补水接种，装盘发酵，发酵终点以酸度来决定，定期测定

在食品添加剂方面主要用于碳酸饮料、果汁饮料、乳酸饮料等清凉饮料和腌制品，其需求量受季节气候的变化而有所变化。柠檬酸约占酸味剂总消耗量的2/3。在水果罐头中添加柠檬酸可保持或改进水果的风味，提高某些酸度较低的水果罐藏时的酸度（降低pH值），减弱微生物的抗热性和抑制其生长，防止酸度较低的水果罐头常发生的细菌性胀罐和破坏。在糖果中加入柠檬酸作为酸味剂易于和果味协调。在凝胶食品如果酱、果冻中使用柠檬酸能有效降低果胶负电荷，从而使果胶分子间氢键结合而凝胶。在加工蔬菜罐头时，一些蔬菜呈碱性反应，用柠檬酸作pH调整剂，不但可以起到调味作用，还可保持其品质。柠檬酸所具有螯合作用和调节pH值得特性使其在速冻食品的加工中能增加抗氧剂的性能，抑制酶活性，延长食品保存期 [23]。
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